Soutenance de thèse de AZIZI Josiane
Titre de thèse
Mécanismes moléculaires de l'oxydation du fer par les Zetaproteobacteries provenant des tapis microbiens riches en fer des grands fonds marins: Focus sur Ghiorsea bivora
Molecular mechanisms of Iron Oxidation by Zetaproteobacteria
from deep sea iron rich microbial mats: Focus on Ghiorsea bivora
Résumé de la thèse
Le fer est un élément clé des cycles biogéochimiques marins, où il régule la productivité primaire
et le cycle global du carbone. Dans les zones hydrothermaux des fonds marins, les bactéries
neutrophiles ferrooxydantes, en particulier les Zetaproteobactéries, catalysent l'oxydation du Fe(II)
afin d'obtenir de l'énergie et de soutenir leur croissance, contribuant ainsi à la formation de tapis
microbiens riches en fer. Malgré leur importance écologique, les mécanismes moléculaires d'
oxydation du fer restent mal compris. Le cytochrome Cyc2, une porine de la membrane externe
dotée d'un domaine hème c du coté N-terminale, s'est révélé être une protéine clé impliquée dans
l'oxydation du fer chez les Zetaproteobacteries et d'autres organismes ferrooxydants.
Cette thèse porte sur la production hétérologue et la caractérisation du Cyc2TAG1 cluster 1 de
Ghiorsea bivora TAG-1, une Zetaproteobacterie isolée d'un tapis microbien hydrothermal de la
dorsale médio-atlantique, à une profondeur de 3,626 m sous le niveau de la mer. Cette
caractérisation permettra d'approfondir la compréhension de son rôle et de mieux comprendre
l'oxydation du fer médiée par Cyc2. Après avoir optimisé la production hétérologue et la
purification de Cyc2TAG1_1 chez Escherichia coli BL21, un test in vitro a été mis au point pour
démontrer son activité ferrooxydante, en utilisant le Fe(II) comme donneur d'électrons et le 2,6
dichlorophénolindophénol (DCPIP) comme accepteur d'électrons terminal. Les paramètres
cinétiques apparents (Km, Vmax, kcat et activité spécifique) ont été déterminés, fournissant ainsi
la première caractérisation biochimique d'un homologue de Cyc2 du cluster 1 issu des
Zetaproteobacteries. Des analyses spectroscopiques ont permis de déterminer que Cyc2 est un
cytohrome à bas spin dont le fer de l'hème possède deux ligands axiaux : une histidine en cinquième
position et une histidine ou une méthionine en sixième position. Le potentiel rédox a été mesuré à
−130 mV par rapport à l'électrode standard à hydrogène (SHE) à pH 7.
Au niveau des fonds marins, la pression hydrostatique augmente linéairement avec la profondeur
sous l'effet de la colonne d'eau sous-jacente, atteignant environ 36 MPa pour G.bivora. Le
deuxième objectif de ce travail était donc d'étudier l'oxydation du Fe(II) médiée par Cyc2TAG1_1
dans des conditions de pression hydrostatique représentatives de son habitat naturel. À cette fin, un
nouveau dispositif expérimental à haute pression a été conçu et validé pour suivre en temps réel
l'oxydation enzymatique du Fe(II). Grâce à ce système, il a été démontré que Cyc2TAG1_1 conservait
son activité jusqu'à 30 MPa.
Dans l'ensemble, ces travaux fournissent la première caractérisation biochimique et biophysique
de Cyc2TAG1_1 et établissent une nouvelle plateforme expérimentale pour l'étude des enzymes
ferrooxydantes sous des pressions hydrostatiques pertinentes sur le plan environnemental.
Thesis resume
Iron is a key element in marine biogeochemical cycles, where it regulates primary productivity and
global carbon cycling. In deep-sea hydrothermal environments, neutrophilic iron-oxidizing
bacteria, particularly members of the Zetaproteobacteria, catalyze Fe(II) oxidation to obtain energy
and support growth, thereby contributing to the formation of iron-rich microbial mats. Despite their
ecological importance, the molecular mechanisms of iron oxidation remain poorly understood.
Cytochrome Cyc2, an outer membrane porin with an N-terminal heme c domain, has emerged as a
key protein involved in iron oxidation in Zetaproteobacria and other iron oxidizers. This thesis
focuses on the heterologous production and characterization of Cyc2TAG1 cluster 1 from Ghiorsea
bivora TAG-1, a deep-sea iron-oxidizing Zetaproteobacteria isolated from a hydrothermal
microbial mat at the Mid-Atlantic Ridge at a depth of 3,626 m below sea level (mbsl). This
characterization will lead to deeper insights into its role and better understand Cyc2-mediated iron
oxidation.
After optimizing the heterologous production and purification of Cyc2TAG1_1 in Escherichia coli
BL21, an in vitro assay was established to demonstrate its iron-oxidizing activity using Fe(II) as
the electron donor and 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP) as the terminal electron acceptor.
Apparent kinetic parameters (Km, Vmax, kcat, and specific activity) were determined, providing
the first biochemical characterization of a Cluster 1 Cyc2 homolog from Zetaproteobacteria.
Spectroscopic analyses revealed that Cyc2 is a low-spin cytochrome in which the heme iron is
coordinated by two axial ligands: a histidine as the fifth axial ligand and either a histidine or a
methionine as the sixth axial ligand. The redox potential was measured to be −130 mV versus the
standard hydrogen electrode (SHE) at pH 7.
As Zetaproteobacteria inhabit deep-sea environments, hydrostatic pressure increases linearly with
depth due to the overlying water column, reaching approximately 36 MPa for G. bivora. The
second objective of this work was therefore to investigate Cyc2TAG1_1-mediated Fe(II) oxidation
under hydrostatic pressure conditions representative of its natural habitat. To this end, a novel high
pressure experimental setup was designed and validated to monitor enzymatic Cyc2TAG1_1
mediatied-Fe(II) oxidation in real time, under hydrostatic pressure conditions. Using this system,
Cyc2TAG1_1 was shown to retain its iron-oxidizing activity up to 30 MPa.
Overall, this work provides the first biochemical and biophysical characterization of Cyc2TAG1_1
and establishes a new experimental platform for studying iron-oxidizing enzymes under
environmentally relevant hydrostatic pressures.